1980'lerin sonlarında, gelişmiş lazer konfokal mikroskopinin önemli bir kusuru vardır: konfokal açıklık, yalnızca odak noktasının dışında üretilen flüoresanı engellemekle kalmaz, aynı zamanda odak noktası tarafından üretilen ve biyolojik dokular tarafından saçılan flüoresanı da bloke eder. floresansın toplama etkinliğinde azalmaya neden olur ve görüntüleme derinliği 100 mikrometreden fazla olamaz. Bu nedenle, 1990'larda, lazer konfokal mikroskopi ile iki fotonlu uyarma teknolojisini birleştiren iki fotonlu floresan mikroskopisi ortaya çıktı. İki foton soğurma işleminin uyarma dalga boyu genellikle, ultraviyole ışığın hücrelere veya canlı organizmalara zarar vermesini önleyen ve daha derine nüfuz eden 680-1080 nm biyo-optik pencere aralığında ayarlanır.
Şu anda en yaygın kullanılan iki fotonlu floresan mikroskobu, yaşam bilimleri, kimya ve tıp gibi çeşitli alanlarda iki fotonlu floresan mikroskopi uygulamasını sınırlayan, hacimli ve pahalı olan femtosaniye titanyum değerli taş lazeridir. Bu nedenle, tıbbi teşhis gibi bazı alanlarda, insanlar kompakt ve uygun fiyatlı nanosaniye altı katı hal lazerlerini standart ışık kaynağı olarak kullanmaya çalıştılar.
İki fotonlu uyarımın temel ilkesi, bir flüoresan molekülü yüksek foton yoğunluğu altında uyarıldığında, aynı anda iki uzun dalga boylu fotonu soğurması ve uyarma sıçramaları ve gevşeme süreçlerinden sonra spontan olarak flüoresan fotonları temel duruma geri yaymasıdır. Geleneksel tek fotonlu uyarmalı floresan mikroskopi ile karşılaştırıldığında, iki fotonlu uyarmalı floresan mikroskobundaki optik sinyal üretimi lineer değildir; uyarma ışığı daha uzun dalga boyuna, daha yüksek tepe gücüne sahip bir ışık kaynağıdır ve yayılan floresan fotonlar bir dalga boyuna sahiptir. uyarma dalga boyunun yarısından biraz daha uzun.
İki Fotonlu Floresan Mikroskopisi, yakın kızılötesi bir lazer ışık kaynağı kullanır ve doğrusal olmayan doğası, bir konfokal açıklık gerektirmez. Bu nedenle, konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, iki fotonlu floresan mikroskopi aşağıdaki avantajlara sahiptir:
- Büyük görüntüleme derinliği ve düşük optik hasar;
- Konfokal açıklık gerekmez ve flüoresans toplama verimliliği büyük ölçüde iyileştirilir;
- Daha yüksek uzamsal çözünürlük ve kontrast;
- Küçük uyarma aralığı, küçük fototoksisite ve ağartma;
- Emisyon ve uyarma dalga boyları birbirinden uzaktır ve spektral örtüşmeyi önler;
